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② 非對稱引物的應用
不對稱PCR不對稱PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一對引物，PCR擴增後產生大量的單鏈DNA(SSDNA).這對引物分別稱為非限制引物與限制性引物，其比例一般為50～100∶1.在PCR反應的最初10～15個循環中，其擴增產物主要是雙鏈DNA，但當限制性引物(低濃度引物)消耗完後，非限制性引物(高濃度引物)引導的PCR就會產生大量的單鏈DNA.不對稱PCR的關鍵是控制限制性引物的絕對量，需多次摸索優化兩條引物的比例.還有一種方法是先用等濃度的引物PCR擴增，制備雙鍵DNA，(dsDNA)，然後以此dsDNA為模板，再以其中的一條引物進行第二次PCR，制備ssDNA.不對稱PCR制備的ssDNA，主要用於核酸序列測定. 不對稱PCR（Asymmetric PCR）的基本原理是採用不等量的一對引物產生大量的單鏈DNA（ss-DNA）。這兩種引物分別稱為限制性引物與非限制性引物；其最佳比例一般為1：50～1：100，關鍵是限制引物的絕對量。限制性引物太多太少，均不利於制備ss-DNA。也可用普通PCR制備靶DNA雙鏈DNA（ds-DNA），再以ds-DNA為模板，只用其中一種過量引物進行單引物PCR制備ss-DNA。 產生的ds-DNA與ss-DNA由於分子量不同可以在電泳中分開，而得到純ss-DNA。 不對稱PCR主要為測序制備ss-DNA，尤為用cD－NA經不對稱PCR進行DNA序列分析是研究真核DNA外顯子的好方法。
一種不對稱PCR擴增方法及其專用引物與應用
申請專利號 CN200410056866.0
專利申請日 2004.08.26
名稱 一種不對稱PCR擴增方法及其專用引物與應用
公開（公告）號 CN1629305
公開（公告）日 2005.06.22
類別 化學；冶金
頒證日
優先權
申請（專利權） 北京博奧生物晶元有限責任公司;清華大學
地址 102206北京市昌平區生命科學園路18號
發明（設計）人 張治位;王璨;祝令香;張瓊;程京
國際申請
國際公布
進入國家日期
專利代理機構 北京紀凱知識產權代理有限公司
代理人 關暢
摘要
本發明公開了一種不對稱PCR擴增方法及其專用引物與應用，目的是提供一種能簡單、高效的制備單鏈擴增產物的PCR擴增方法。本發明所提供的不對稱PCR引物，包括若干對PCR引物對，其特徵在於：每對所述引物對中的一條引物的5′末端均加有一段與待擴增靶序列無關的寡核苷酸尾。所提供的不對稱PCR擴增方法，包括如下步驟：1)預變性；2)包括若干變性、引物退火和引物延伸循環的第一部分PCR擴增；3)包括若干變性和引物延伸循環的第二部分PCR擴增。所述引物延伸中所用PCR引物對中的一條引物的5′末端均加有一段與待擴增靶序列無關的寡核苷酸尾。本發明的不對稱PCR擴增方法單鏈產率高，可進行單重或多重PCR擴增，在核酸檢測中可以得到廣泛應用。
主權項
1、一種不對稱PCR引物，包括若干對PCR引物對，其特徵在於：每對所述引物對中的一條引物的5′末端均加有一段與待擴增靶序列無關的寡核苷酸尾。
PCR產物的直接測序
凝膠純化PCR擴增的靶序列
如果最佳PCR反應條件不能產生所需的特異性產物，可採用新的寡核苷酸重新進行擴增，或用凝膠電泳來分離不同的PCR產物，而後再各自重新擴增進行序列分析。長度不同的片段可以用瓊脂糖凝膠電泳來分離:
1.片段大小在80-100bp時，可採用3%NuSieve1%普通瓊脂糖或用聚丙烯醯胺膠來分離。
2.從膠上切下含所南非PCR片段的薄片。
3.加入50∽100μlTE浸泡膠片，可反復凍融或放置幾個小時使DNA從膠中擴散出來。
4.取少量(1-5%)進行第二次擴增，為得到純凈單一的產物，用於第二次PCR擴增 的凝膠抽提物的量必須少於1ng。
5.現已發現瓊脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物質。因而，如需重新擴增供Tab聚合酶測序用的片段，最好用丙烯醯胺電泳分離。
當用PCR引物擴增幾個同樣長度的相關序列時，如來自幾個新近復制的基因，或重復序列或保守的信號序列(conserved signal sequences)的同樣顯子，可以通過下列兩種不同方法來改進電泳分離。1).先用只切割某一模板的內切酶進行酶切，而後電泳純化完整的PCR產物。2).用可使核苷酸序列不同的擴增產物分開的電泳系統。下一個部份將討論此類系統中的變性甲醯胺梯度凝膠系統。採用方法一時，必須事先了 解在不同PCR產物中的內切酶位點。
雜合體的直接測序
當兩個等位基因由於單一位點突變而產生差異時，用一個PCR引物直接進行測序，能找出雜合位點。但是，帶有幾個點突變或短片段的插入/缺失的等位模板用PC R引物之一來直接測序，將產生復合序列帶(compound sequencing ladders)。有四種 方法可以確定幾種點突在型並從雜合體中獲得單個等位基因的序列:1).克隆分離不同 的模板;2).在測序之前，利用模板之間核苷酸序列的差異，用電泳技術分離不同的模 板;3).在測序反應中只啟動一個等位基因;4).只擴增一個等位基因。
測序模板的制備
與PCR產物的直接測序有關的一些問題是變性後由於擴增片段的兩條鏈可以迅速結合起來，從而阻止了測序引物與它的互補序列退火，或阻止了引物──模板復合物的延伸。在測序反應中，模板鏈重新結合使一小部份模析驂與測序從而弱化最終的測序條帶。為減少此問題，可用改進的標准雙鏈DNA測序法或用PCR制備單鏈模板。
雙鏈DNA模板
有兩種不同方法用來制備測序用的模板，目前都已用來測定共價閉環雙鏈質粒模板的序列。用這些方法來進行PCR產物的測序通常是較困騅的，因為短的線性模板比團環質粒的雙鏈更易於重新結合。在這兩種方法中，PCR片段可以由凝膠電膠或在電 泳前先進行旋轉透析(Spin-dialysis)純化。
1.在室溫下，模板先在0.2M NaOH中變性5分鍾，冰凍，加入0.4倍的5M醋酸銨 (pH7.5)來中和反應。立即用四體積的無水乙醇沉澱DNA。在合適的退火溫度下，加入 測序緩沖引物。
2.在95℃下保溫5分鍾來變性模板，冰浴(或在乾冰乙醇中)快速冷卻離心管，以 減少鏈的重新結合。加入測序引物並使反應達到合適的溫度。測序引物在變性前或後 加入都合適。
單鏈DNA模板
使用單鏈模板可以避免測序中鏈的重新結合。單鏈模板可以從雙鏈DNA模板經鏈分離凝膠中制備，或用PCR反應制備。大於500bp的單鏈DNA片段，可從瓊脂糖凝膠中分離笪到，但它不適合於更短的單鏈。制備單鏈DNA的另一種不同方法是在PCR反應中使用一個生物素標記的引物，變性後的PCR產物經過一個親合素柱而使兩條鏈得到分離，只有生物素標記的鏈才可結合到柱上。然而，最簡單的方法是用改進的PCR方法，用此方法制備既定的單鏈DNA。在這個反應中(不對稱PCR，asymmetric PCR)，在開始的20-25個循環中，兩個比率不對稱的擴增引物產生出雙鏈DNA，當限量的那個引物耗光後，隨後的5-10個循環就產生出ssDNA。單鏈DNA在約在25個循環後開始出現，這時限量的引物也幾乎耗盡。經過一個短暫快速上升後，ssDNA就開始如預期的那樣呈線性積累，這時反應中僅有一個引物存在。各種比率的引物都以這種形式產生 ssDNA。一般對100μlPCR反應體系而言，引物比率為50pmo:0.5pmol，經過30個循環後，大約可產生1-3pmol的ssDNA。ssDNA的產量可用下列幾種方法來估計:a)。在PCR 反應中，除了加入正常數量的dDNA外，還加入32P-dNTP。取10%的反應產物在薄的3% NuSieve+1%普通瓊脂糖凝膠中電泳，乾燥並與膠片一起曝光。b).取5%的反應物來走膠，轉移到膜上，並用與ssDNA互補的寡核苷酸為探針雜交。ssDNA不能用EB染色來定量，因為ssDNA有形成二級結構的趨勢且染料的插入在模板中是隨機的。使用不對稱引物比例的擴增效率比兩種引物均過量80-90%)的擴增效率低(70%)。在實驗中，這可通過增加PCR循環的次數來彌補。若不對稱的PCR反應不能產生足夠數量的ssDNA，可以試一試不同的引物比率;b).再加5-10個PCR循環;c).在最後五個循環中多加Tab聚合酶(2U);d).試一下相反的不對稱引物比率。有時，相反的不對稱引物比率可能給出不同產量的ssDNA。制備出的單鏈DNA用限量的那個PCR引物或用一個內引物來測序，並 應用常規方法進行摻入測序(incorporation sequencing)或標記引物測序。制備出的 ssDNA鏈可能有一個不連續的5'-末端，但可能在靠近3'-末端不同位點處被切去，這是由於延伸過程中終止過早所產生的。然而，對於測序反應中所使用的任何一種引 物，只有完整的ssDNA可以用作測序模板。
最近還報道了另一種方法制備單鏈核酸模板進行直接測序。這種方法包括在一個 PCR引物上加入噬菌體的啟動子，轉錄出該PCR產物的RNA拷貝，再用反轉錄酶不測序。但由於擴增反應後附加了一個酶促反應步驟和限於用反轉錄酶作為測序酶，這種 方法的應用受到很大的限制。
雙鏈DNA模板
有兩種不同方法用來制備測序用的模板，目前都已用來測定共價閉環雙鏈質粒模板的序列。用這些方法來進行PCR產物的測序通常是較困騅的，因為短的線性模板比團環質粒的雙鏈更易於重新結合。在這兩種方法中，PCR片段可以由凝膠電膠或在電 泳前先進行旋轉透析(Spin-dialysis)純化。
1.在室溫下，模板先在0.2M NaOH中變性5分鍾，冰凍，加入0.4倍的5M醋酸銨 (pH7.5)來中和反應。立即用四體積的無水乙醇沉澱DNA。在合適的退火溫度下，加入 測序緩沖引物。
2.在95℃下保溫5分鍾來變性模板，冰浴(或在乾冰乙醇中)快速冷卻離心管，以 減少鏈的重新結合。加入測序引物並使反應達到合適的溫度。測序引物在變性前或後 加入都合適。
單鏈DNA模板
使用單鏈模板可以避免測序中鏈的重新結合。單鏈模板可以從雙鏈DNA模板經鏈分離凝膠中制備，或用PCR反應制備。大於500bp的單鏈DNA片段，可從瓊脂糖凝膠中分離笪到，但它不適合於更短的單鏈。制備單鏈DNA的另一種不同方法是在PCR反應中使用一個生物素標記的引物，變性後的PCR產物經過一個親合素柱而使兩條鏈得到分離，只有生物素標記的鏈才可結合到柱上。然而，最簡單的方法是用改進的PCR方法，用此方法制備既定的單鏈DNA。在這個反應中(不對稱PCR，asymmetric PCR)，在開始的20-25個循環中，兩個比率不對稱的擴增引物產生出雙鏈DNA，當限量的那個引物耗光後，隨後的5-10個循環就產生出ssDNA。單鏈DNA在約在25個循環後開始出現，這時限量的引物也幾乎耗盡。經過一個短暫快速上升後，ssDNA就開始如預期的那樣呈線性積累，這時反應中僅有一個引物存在。各種比率的引物都以這種形式產生 ssDNA。一般對100μlPCR反應體系而言，引物比率為50pmo:0.5pmol，經過30個循環後，大約可產生1-3pmol的ssDNA。ssDNA的產量可用下列幾種方法來估計:a)。在PCR 反應中，除了加入正常數量的dDNA外，還加入32P-dNTP。取10%的反應產物在薄的3% NuSieve+1%普通瓊脂糖凝膠中電泳，乾燥並與膠片一起曝光。b).取5%的反應物來走膠，轉移到膜上，並用與ssDNA互補的寡核苷酸為探針雜交。ssDNA不能用EB染色來定量，因為ssDNA有形成二級結構的趨勢且染料的插入在模板中是隨機的。使用不對稱引物比例的擴增效率比兩種引物均過量80-90%)的擴增效率低(70%)。在實驗中，這可通過增加PCR循環的次數來彌補。若不對稱的PCR反應不能產生足夠數量的ssDNA，可以試一試不同的引物比率;b).再加5-10個PCR循環;c).在最後五個循環中多加Tab聚合酶(2U);d).試一下相反的不對稱引物比率。有時，相反的不對稱引物比率可能給出不同產量的ssDNA。制備出的單鏈DNA用限量的那個PCR引物或用一個內引物來測序，並 應用常規方法進行摻入測序(incorporation sequencing)或標記引物測序。制備出的 ssDNA鏈可能有一個不連續的5'-末端，但可能在靠近3'-末端不同位點處被切去，這是由於延伸過程中終止過早所產生的。然而，對於測序反應中所使用的任何一種引 物，只有完整的ssDNA可以用作測序模板。
最近還報道了另一種方法制備單鏈核酸模板進行直接測序。這種方法包括在一個 PCR引物上加入噬菌體的啟動子，轉錄出該PCR產物的RNA拷貝，再用反轉錄酶不測序。但由於擴增反應後附加了一個酶促反應步驟和限於用反轉錄酶作為測序酶，這種 方法的應用受到很大的限制。
③ 從植物中提取有效成分的裝置
：一提取裝置，一換熱器，其內設置有預熱換熱管和冷卻換熱管，提取裝置分別通過管路連接預熱換熱管和冷卻換熱管的進液口，冷卻換熱管的出液口通過管路連接一三通閥；三通閥通過管路分別連接一四通閥和一輸液泵的進液口；該四通閥的另外三個口分別通過管路連接一個沖洗液罐和兩個溶液罐；預熱換熱管的出液口通過管路連接一三通閥，三通閥通過管路分別連接一擴張床的上埠和一四通閥，該四通閥的另外三個口分別連接輸液泵的出液口、擴張床的下埠和一自動收集器，在擴張床下埠和自動收集器進液口之間管路上的四通閥兩端並聯一在線檢測控制器。採用本實用新型提取分離中葯有效成分效率高、步驟簡化、操作周期時間短、有效成分獲得比例高。
申請日： 2006年11月10日
公開日：
授權公告日： 2007年10月31日
申請人/專利權人： 清華大學
申請人地址： 北京市海淀區清華大學化學系
發明設計人： 羅國安;張敏;王義明;楊輝華;胡坪;梁瓊麟
專利代理機構： 北京紀凱知識產權代理有限公司
代理人： 徐寧 關暢
專利類型： 實用新型專利
分類號： A61J3/00
④ 復合型低溫等離子滅菌櫃；發明專利：032658540 的具體內容是什麼
申請（專利）號：03265854.0大中小
實用新型說明書 （16）頁申 請 號： 03265854.0 申 請 日： 2003.05.26
名 稱： 滅菌箱
公 開 (公告) 號： CN2631495 公開(公告)日： 2004.08.11
主 分 類 號： A61L2/20 分案原申請號：
分 類 號： A61L2/20;A61L2/00
頒 證 日： 優 先 權：
申請(專利權)人： 孫英軍
地 址： 100073 北京市六里橋北里空軍干休所2號樓
發 明 (設計)人： 孫英軍 國 際 申 請：
國 際 公 布： 進入國家日期：
專利 代理 機構： 北京紀凱知識產權代理有限公司 代 理 人： 關暢
摘要
本實用新型公開了一種滅菌箱，主要是利用臭氧氣體殺滅細菌、消毒物品。其目的是提供一種結構簡單、密封性能好，處理量大，消毒滅菌效率高的新型滅菌箱。其技術方案為：一種滅菌箱，包括一個帶有密封蓋的密封櫃體，在密封櫃體內設有密封隔板，其將密封櫃體分隔為滅菌室與控制室；密封隔板上設有進氣口與排氣口，其分別連通滅菌室與控制室；其特徵在於：滅菌室內設有感測器；控制室內設有臭氧發生器，其輸入端設一空氣入口，輸出端通過管道與輸氣系統相接，輸氣系統通過管道與臭氧還原器相接；所述控制室內還設置有智能控制板，其通過線路與控制室內的各部件與電源組件連接，其結構緊湊，充氣量大，對消毒物體無毒無害；可實現自動控制。