发明了链终止法进行测序

1. 英国科学家Sanger因发明了链终止DNA测序法而获诺贝尔奖．其主要内容步骤是：先向DNA复制体系中加入能够终

（1）让DNA分子的两条链分开，在体外是采用加热变性的方法，在活细胞内依靠DNA解旋酶．
（2）由于模板链中含N个腺嘌呤脱氧核苷酸，标记物是腺嘌呤脱氧核苷酸，通过上述操作能得到N种长度不同的脱氧核苷酸链．
（3）各种长度不同的脱氧核苷酸链的分子量不同，因而可以通过电泳将它们分离开来．
（4）碱基G所在的核苷酸为鸟嘌呤核苷酸，所以若用上述测序方法读出碱基G的位置，则必须加入带标记的鸟嘌呤核苷酸．
（5）按上图模式每操作1次，能够测出一条链中1种碱基的位置，DNA分子中有4种碱基，操作3次就能测出DNA一条链上3种碱基的位置，空位自然是第4种碱基．再根据碱基互补配对原则，可推知DNA片段上另一条链的碱基顺序．所以从理论上讲，只要按上图模式操作3次，就能测定一段双链DNA中的全部碱基顺序．
故答案为：
（1）解旋酶
（2）N
（3）分子量
（4）鸟嘌呤核苷酸
（5）3

2. 末端终止法测序的原理和方法

末端终止法测DNA序列即SANGER双脱氧链终止法,其原理是:

DNA链中核苷酸以3’,5’-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是 2’-脱氧核苷三磷酸。2’,3’ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3’羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。

3. 可逆末端终止测序法的原理

双脱氧末端终止法

在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。

双脱氧链终止法是现在应用最多的核酸测序技术，由Sanger等1977年提出。

其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。

(一) Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序 操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的。

1. 分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。

2. 2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记dATP，例如?32 PdATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。

3. 3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理)结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。

4. 4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP)，则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一种双脱氧碱基。

5. 5.放射自显影。根据四泳道的编号和 每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。
   

4. 双脱氧末端终止法测序的基本步骤包括哪些

以双链DNA测序为例，双脱氧末端终止法的基本步骤包括：变性双链模板的制备和延伸和终止反应。

1、变性双链模板的制备

① 取1.5ml处于对数生产期的培养菌液（含有待测病毒核酸的重组质粒模板），离心除去上清液后，用150ml Tris/葡萄糖缓冲液重悬菌团，在室温下放置5分钟。

② 加入300ml的1%SDS，0.2mol/L NaOH，颠倒混合约15次，在室温下放置15分钟，加入225ml 3mol/L醋酸钠（pH4.5），颠倒约15次混合，在冰浴中放置45分钟，离心5分钟。

③ 将650ml上清液转移至一支新管中，加入650ml异丙醇，混合后在室温下放置10分钟，离心5分钟后弃去异丙醇，抽真空干燥沉淀。

④ 用125ml TE(pH 8.0）重新溶解DNA，加入375ml的4mol/L LiCl，在冰浴中放置20分钟后，于4℃下离心5分钟。

⑤ 将上清液转移至一支新管中用饱和苯酚抽提后再用氯仿抽提，加入2倍体积的异丙醇，在室温下沉淀30分钟，离心5分钟，弃去上清液。

⑥ 用冰冷的70%乙醇洗沉淀，离心5分钟，弃去上清液并干燥，用50ml TE缓冲液重新溶解沉淀。用紫外分光光度计测定质粒DNA含量。

⑦ 取0.2mg质粒DNA，并将体积调至9ml，加入1ml 2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA，在室温下放置5分钟，加入2ml 30mol/L醋酸钠（pH 4.5）和8ml水。

⑧ 加入6ml冰冷无水乙醇，混合后在干冰/乙醇浴中放置15分钟，在4℃下离心5分钟，小心地弃去上清液，用冰冷的70%乙醇洗沉淀，离心5分钟并小心地弃去上清液，真空抽干沉淀，并用TE缓冲液重新溶解沉淀。

2、延伸和终止反应

以利用T7DNA聚合酶进行的双脱氧链终止反应为例。

① 取4支0.5ml小离心管，标上G、A、T、C，每管加入7ml变性的双链DNA模板（分别为1和2mg），1ml寡核苷酸引物和2ml 5×测序缓冲液混合，65℃保温2分钟，在室温下冷却30分钟。

② 每管加入1ml 0.1mol/L DTT，2ml 1.5mol/L 3种dNTP混合物，0.5ml32P dATP和2ml（2IU）修饰的T7DNA多聚酶混合物，在室温下放置5分钟。

③ 按标记每管分别加入3ml 4种ddNTP终止混合物的一种。

④ 短促离心后，在37℃下保温5分钟。

⑤ 加入5ml甲酰胺上样缓冲液，上样前在80℃下加热2分钟，并迅速置于冰浴上，每个样品取3ml，上样电泳。

⑥读取合成链的核苷酸序列。

(4)发明了链终止法进行测序扩展阅读

延伸和终止反应中测序反应物电泳和序列读取的注意事项：

（1） 按普通聚丙烯酰胺凝胶制作方法制作梯度胶。

（2） 按G、A、T、C次序加入每种样品，在G、A和T各泳道上样1ml，而在C泳道上样1.5ml。

（3） 上样完毕加压1700V电泳，根据样品中溴酚蓝和二甲苯青染料迁移情况确定电泳时间。

（4） 电泳完毕，在10℃冰醋酸中漂洗30分钟脱去尿素。

（5） 在60℃或80℃干燥30分钟后，放射自显影读取序列。

5. 双脱氧末端终止法测序原理

DNA链中核苷酸以3’,5’-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是 2’-脱氧核苷三磷酸。2’,3’ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3’羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争，产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置

6. 链终止法dna测序技术有何特点

链终止法又叫双脱氧末端测序法，特异性高，可区分一个碱基的差别，四色荧光，末端终止

7. 双脱氧链终止法的原理

双脱氧链终止法是现在应用最多的核酸测序技术（也即第一代DNA测序技术），由Sanger等1977年发明提出。主要用于DNA基因分析。其原理是：
核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。
如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
Sanger双脱氧链终止法（酶法）测序程序 操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的。
1.分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。
2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP（包括放射性标记的ddNTP，例如32P ddNTP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP（双脱氧核苷酸）。
3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理）结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。
4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP（如ddATP），则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基（如A）处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一种双脱氧碱基。
5.放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。

8. 英国科学家Sanger因发明了链终止DNA测序法而再获诺贝尔奖．通过向DNA复制体系中加入能够终止新链延伸的某

（1）DNA分子两条链之间通过氢键连接，所以实验操作的第一步是通过加热破坏从而使DNA分子的双链打开，在细胞中这是在解旋酶的作用下完成的．
（2）根据碱基互补配对原则，由于模板链的碱基序列是ATGATCCTG，所以对应合成的最长新链的碱基序列是TACTAGGAC．
（3）据图分析，要通过以上操作精确地测出DNA链上每一个碱基的位置，电泳分离结果必须能把长度只差一个碱基（或脱氧核苷酸）的DNA链区分开来．
（4）由于鸟嘌呤G与胞嘧啶C配对，所以要从电泳结果直接读出上图模板链中鸟嘌呤的位置，进行以上操作时，必须加入带标记的胞嘧啶脱氧核苷酸类似物．由于模板链上只有2个鸟嘌呤，所以扩增后将产生2种带标记的新链．
（5）由于经过3次操作可以测出DNA片段的一条链上三种碱基的位置，剩下空位就是第四种碱基的位置；再根据碱基互补配对原则，可推知DNA另一条链的碱基顺序．因此，采用链终止法测定一段DNA双链中的全部碱基顺序，最少要按图中所示模式操作3次．
故答案为：
（1）氢键解旋酶
（2）TACTAGGAC
（3）长度只差一个碱基（或脱氧核苷酸）的DNA链
（4）①加入胞嘧啶脱氧核苷酸类似物（或ddCMP）
②2种 因为模板链上只有2个鸟嘌呤（或新链上只有2个胞嘧啶）
（5）经过3次操作可以测出DNA片段的一条链上三种碱基的位置，剩下空位就是第四种碱基的位置；再根据碱基互补配对原则，可推知DNA另一条链的碱基顺序

9. 双脱氧链终止法的Sanger双脱氧链终止法（酶法）测序程序

（一） Sanger双脱氧链终止法（酶法）测序程序 操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的。
1.分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。
2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP（包括放射性标记的ddNTP，例如32P ddNTP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP（双脱氧核苷酸）。
3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理）结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。
4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP（如ddATP），则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基（如A）处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一种双脱氧碱基。
5.放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。