二抗有效期

Ⅰ elisa試劑盒開封以後可以在4度冰箱里放多久

國產還是進口，進口長久一些，試劑盒沒用明確保存時間，基本上打開後最佳是30天以內（4度）
關鍵是你想啊，包被的東西，出廠就弄好了，這個就要一段時間，再到你手上。。。最好打開一次全用。。。。其實試劑盒也沒多少錢，我們經常就是用十幾個孔就換新的了。。。。1個月的話，沒問題，但是最好這次用不完，就別用了

下午我問導師了，導師說半年。。。。。你才1各月，沒事的，放心用

Ⅱ 如何通過蛋白質相互作用研究蛋白質在某疾病的發病過程中的分子機制(5種方法)

研究蛋白質與DNA相互作用的主要方法
一、引言
在許多的細胞生命活動中，例如DNA復制、mRNA轉錄與修飾以及病毒的感染等都涉及到DNA與蛋白質之間的相互作用的問題。
重組DNA技術的發展，人們已分離到了許多重要的基因。現在的關鍵問題是需要揭示環境因子及發育信號究竟是如何控制基因的轉錄活性。為此需要：
a、鑒定分析參與基因表達調控的DNA元件；
b、分離並鑒定這些順式元件特異性結合的蛋白質因子；
這些問題的研究都涉及到DNA與蛋白質之間的相互作用。
研究DNA-蛋白質相互作用的實驗方法主要包括：
a、凝膠阻滯實驗； b、DNase 1 足跡實驗；
c、甲基化干擾實驗； d、體內足跡實驗； f、拉下實驗。
二、凝膠阻滯實驗
1、概念：
凝膠阻滯實驗（Gel retardation assay），要叫做DNA遷移率變動試驗（DNA mobility shift assay）或條帶阻滯實驗（Band retardation assay）是在八十年代初期出現的用於在體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。
2、原理：
在凝膠電泳中，由於電場的作用，裸露的DNA分子向正電極移動距離的大小是同其分子量的對數成反比。如果某種DNA分子結合上一種特殊的蛋白質，那麼由於分子量的加大它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，於是朝正極移動的距離也就相應的縮短，因而在凝膠中出現滯後的條帶，這就是凝膠阻滯實驗的基本原理。
3、過程:
1) 首先制備細胞蛋白質提取物（理論上其中含有某種特殊的轉錄因子）
2) 用放射性同位素標記待檢測的DNA片段（含有轉錄因子的結合位點）
3) 這種被標記的探針DNA同細胞蛋白質提取物一起進行溫育，於是產生DNA-蛋白質復合物
4) 在控制使DNA-蛋白質保持結合狀態的條件下，進行非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳
5) 最後進行放射自顯影，分析電泳結果
4、實驗結果的分析：
a、如果有放射性標記的條帶都集中於凝膠的底部，這就表明在細胞提取物中不存在可以同探針DNA相互結合的轉錄因子蛋白質；
b、如果在凝膠的頂部出現放射性標記的條帶，這就表明細胞提取物存在可與探針DNA結合的轉錄因子蛋白質。
5、DNA競爭實驗：
DNA競爭實驗（DNA competitive assay）的具體做法如下：
在DNA-蛋白質結合的反應體系中加入了超量的非標記的競爭DNA（competitor DNA），如果它同探針DNA結合的是同一種轉錄因子蛋白質，那麼由於競爭DNA與探針DNA相比是極大超量的，這樣絕大部分轉錄因子蛋白質都會被競爭結合掉，而使探針DNA仍然處於自由的非結合狀態，可以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上就不會出現阻滯的條帶；
如果反應體系中加入的競爭DNA並不能同探針DNA競爭結合同一種轉錄因子，結果在電泳凝膠中的放射自顯影圖片上就會出現阻滯的條帶。
6、應用：
a、凝膠阻滯實驗可以用於鑒定在特殊類型細胞蛋白質提取物中，是否存在能同某一特定的DNA（含有轉錄因子結合位點）結合的轉錄因子蛋白質；
b、DNA競爭實驗可以用來檢測轉錄因子蛋白質同DNA結合的精確序列部位；
c、通過競爭DNA中轉錄因子結合位點的鹼基突變可以研究此種突變競爭性能及其轉錄因子結合作用的影響；
d、也可以利用DNA同特定轉錄因子的結合作用通過親和層析來分離特定的轉錄因子。
三、足跡實驗
1、定義:
足跡實驗（foot-printing assay），是一種用來檢測被特定轉錄因子蛋白質特異性結合的DNA序列的位置及其核苷酸序列結構的專門實驗方法。
2、原理：
當DNA分子中的某一區段同特異的轉錄因子結合之後便可以得到保護而免受DNaseI 酶的切割作用，而不會產生出相應的切割分子，結果在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現了一個空白區，俗稱為「足跡」。
3過程：
將待檢測的雙鏈DNA分子在體外用32P作5『末端標記，並用適當的限制性內切酶切出其中的一個末端，於是便得到了一條單鏈末端標記的雙鏈DNA
在體外同細胞蛋白質提取物（細胞核提取物也可以）混合，形成DNA-蛋白質復合體
在反應混合物中加入少量的DNase I,並控制用量使之達到平均每條DNA鏈，只發生一次磷酸二酯鍵的斷裂：
a、如果蛋白質提取物中不存在與DNA結合的特定蛋白質，使DNase I消化之後，便會產生出距離放射性標記末端1個核苷酸，2個核苷酸，3個核苷酸------等等一系列前後長度均相差一個核苷酸的不間斷的連續的DNA片段梯度群體；
b、如果DNA分子同蛋白質提取物中的某種轉錄因子結合，被結合部位的DNA就可以得到保護免受DNase I酶的降解作用；
除去蛋白，加樣在20%序列膠上進行電泳分離，實驗分兩組:
a、實驗組：DNA+蛋白質混合物
b、對照組：只有DNA，未與蛋白質提取物進行溫育
最後進行放射性自顯影，分析實驗結果。
4、結果判斷:
實驗組凝膠電泳顯示的序列，出現空白的區域表明是轉錄因子蛋白質結合部；與對照組序列比較，便可以得出蛋白質結合部位的DNA區段相應的核苷酸序列。
5、其他的足跡實驗方法：
除了DNase1足跡試驗之外，目前還發展出了若干種其他類型的足跡實驗，例如：
a、 自由羥基足跡實驗；b、菲咯啉銅足跡實驗；c、DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗
DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗的原理
DMS能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學切割。如果DNA分子中某一區段同轉錄因子結合，就可以避免發生G殘基的甲基化而免受六氫吡啶的切割作用。
四、甲基化干擾實驗
1、概念：
甲基化干擾實驗（Methylation interference assay）是根據DMS（硫酸二甲酯）能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學切割這一原理設計的另一種研究蛋白質同DNA相互作用的實驗方法。
應用這種技術可以檢測靶DNA中G殘基的優先甲基化，對爾後的蛋白質結合作用究竟會有什麼效應，從而更加詳細的揭示出DNA與蛋白質相互作用的模式。
2、實驗步驟：
用DMS處理靶DNA使之局部甲基化（平均每條DNA只發生一個G鹼基甲基化作用）
同細胞蛋白質提取物一起進行溫育，促進使DNA與蛋白質的結合
進行凝膠電泳形成兩種靶DNA條帶：
a、 其一沒有同蛋白質結合的DNA正常電泳條帶
b、其二同特異蛋白質結合而呈現滯後的DNA電泳條帶
將這兩種DNA電泳條帶分別從凝膠中切出，並用六氫吡啶進行切割，結果為：
a、甲基化的G殘基被切割:因為轉錄因子蛋白質只能夠同未發生甲基化的正常的結合位點結合，所以在轉錄因子DNA結合位點序列中的G殘基如果被DMS甲基化之後，轉錄因子就無法同其結合位點（順式元件）發生結合作用，從而使得結合位點中的G殘基同樣也要被六氫吡啶切割；
b、不具有甲基化G殘基的靶DNA 序列則不會被切割
將結合蛋白質的DNA條帶和不結合蛋白質的DNA條帶，經六氫吡啶切割作用之後，再進行凝膠電泳
作放射自顯影，讀片並分析結果
3、結果判斷：
a、同轉錄因子蛋白質結合的靶DNA序列，經六氫吡啶切割之後，電泳分離呈現兩條帶，有一個空白區
b、不同轉錄因子蛋白質結合的靶DNA序列，經六氫吡啶切割後，電泳分離呈現三條帶，沒有空白區域的出現。
4、應用：
a、甲基化干擾實驗可以用來研究轉錄因子與DNA結合位點中的G殘基之間的聯系；
b、是足跡實驗的一種有效的補充手段，可以鑒定足跡實驗中DNA與蛋白質相互作用的精確位置
5、缺點：
DMS只能使DNA序列中的G和A殘基甲基化，而不能使T和C殘基甲基化。
五、體內足跡實驗
上面討論的三種研究轉錄因子與DNA相互作用的方法，有一個共同的不足之處在於它們是在體外進行的實驗，因此人們就會考慮這些實驗結果是否能夠反映細胞內發生的真實生命過程，即細胞內發生的真實的DNA與蛋白質的相互作用情況。
為了解答這個問題，科學家就設計出了一種體內足跡試驗（in vivo foot-printing assay），該方法可以看做是體外DMS足跡實驗的一個變種。
1、原理：
體內足跡試驗的原理原則上同體外DMS足跡實驗無本質差別，即
a、DMS能夠使G殘基甲基化；
b、六氫吡啶能特異的切割甲基化的G殘基；
c、同特異轉錄因子蛋白質結合的識別序列中的G殘基由於受到蛋白質的保護而不會被DMS甲基化，於是不會被六氫吡啶切割；
d、同對照的裸露的DNA形成的序列梯作比較，就會發現活細胞DNA形成的序列梯中缺少G殘基沒有被切割的相應條帶。
2、過程：
用有限數量的化學試劑DMS處理完整的游離細胞，使滲透到胞內的DMS濃度恰好導致天然染色體DNA的G殘基發生甲基化
對這些經過DMS處理的細胞提取DNA，並在體外加入六氫吡啶作消化反應
PCR擴增後作凝膠電泳分析，因為在體外實驗中用的是克隆的DNA片段其數量足夠，而在體內足跡實驗中用的是從染色體DNA中分離獲得的任何一種特異的DNA，其數量是微不足道的，所以需要經PCR擴增以獲得足夠數量的特異DNA
放射自顯影，讀片並記錄讀片的結果
3、結果判斷：
a、能夠同轉錄因子蛋白質結合的DNA區段其中G殘基受到保護因而不會被DMS甲基化避免了六氫吡啶的切割作用；
b、體外裸露的DNA分子上，G殘基被DMS甲基化而被六氫吡啶切割。
六、拉下實驗（Pull-down assay）
拉下實驗又叫做蛋白質體外結合實驗（binding assay in vitro），是一種在試管中檢測蛋白質之間相互作用的方法。其基本原理是將某種小肽（例如生物素、6-His標簽以及谷胱甘肽轉移酶等）的編碼基因與誘餌蛋白的編碼基因重組，表達為融合蛋白。分離純化融合蛋白並與磁珠結合，使之固相化之後，再與表達目的蛋白的細胞提取物混合保溫適當時間，例如在4℃下保溫過夜，使目標蛋白同已經固定在磁珠表面的融合蛋白中的誘餌蛋白充分的結合。離心收集與固定化的融合蛋白（即與磁珠相互結合的融合蛋白）中的誘餌蛋白相結合的目的蛋白，經過煮沸處理使目的蛋白與誘餌蛋白相脫離從而從固相支持物（例如磁珠）上脫離下來，收集樣品，再與目標蛋白的抗體作Western blotting分析，以檢測出與誘餌蛋白的目標的目標蛋白。

染色質免疫共沉澱技術（ChIP） 真核生物的基因組DNA以染色質的形式存在。因此，研究蛋白質與DNA在染色質環境下的相互作用是闡明真核生物基因表達機制的基本途徑。染色質免疫沉澱技術（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究體內DNA與蛋白質相互作用的方法。它的基本原理是在活細胞狀態下固定蛋白質－DNA復合物，並將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段，然後通過免疫學方法沉澱此復合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。CHIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。而且，CHIP與其他方法的結合，擴大了其應用范圍：CHIP與基因晶元相結合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用於特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內足跡法相結合，用於尋找反式因子的體內結合位點；RNA-CHIP用於研究RNA在基因表達調控中的作用。由此可見，隨著CHIP的進一步完善，它必將會在基因表達調控研究中發揮越來越重要的作用。 染色體免疫共沉澱（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基於體內分析發展起來的方法，也稱結合位點分析法，在過去十年已經成為表觀遺傳信息研究的主要方法。這項技術幫助研究者判斷在細胞核中基因組的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾。ChIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。近年來，這種技術得到不斷的發展和完善。採用結合微陣列技術在染色體基因表達調控區域檢查染色體活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神經系統紊亂等疾病的主要代謝通路的一種非常有效的工具。 它的原理是在保持組蛋白和DNA聯合的同時，通過運用對應於一個特定組蛋白標記的生物抗體，染色質被切成很小的片斷，並沉澱下來。IP是利用抗原蛋白質和抗體的特異性結合以及細菌蛋白質的「prorein A」特異性地結合到免疫球蛋白的FC片段的現象活用開發出來的方法。目前多用精製的prorein A預先結合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應後，beads上的prorein A就能吸附抗原達到精製的目的。實驗最需要注意點就是抗體的性質。抗體不同和抗原結合能力也不同，免染能結合未必能用在IP反應。建議仔細檢查抗體的說明書。特別是多抗的特異性是問題。其次，要注意溶解抗原的緩沖液的性質。多數的抗原是細胞構成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強界面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結合。另一面，如用弱界面活性劑溶解細胞，就不能充分溶解細胞蛋白。即便溶解也產生與其它的蛋白結合的結果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結合，即使IP成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結果。再次，為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，低溫下進行實驗。每次實驗之前，首先考慮抗體/緩沖液的比例。抗體過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。 ChIP的一般流程： 甲醛處理細胞---收集細胞，超聲破碎---加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復合物相互結合---加入ProteinA，結合抗體-靶蛋白-DNA復合物，並沉澱---對沉澱下來的復合物進行清洗，除去一些非特異性結合---洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復合物---解交聯，純化富集的DNA-片斷---PCR分析。 在PCR分析這一塊，比較傳統的做法是半定量-PCR。但是現在隨著熒光定量PCR的普及，大家也越來越傾向於Q-PCR了。此外還有一些由ChIP衍生出來的方法。例如RIP（其實就是用ChIP的方法研究細胞內蛋白與RNA的相互結合，具體方法和ChIP差不多，只是實驗過程中要注意防止RNase，最後分析的時候需要先將RNA逆轉錄成為cDNA）；還有ChIP-chip（其實就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做晶元分析，做法在ChIP的基礎上有所改變，不同的公司有不同的做法，要根據公司的要求來准備樣品）。

GST沉澱實驗（GST-pull down實驗）（細胞外蛋白質相互作用）5-11
上面提到，用酵母雙雜交方法篩選到的蛋白需要作進一步的鑒定。鑒定方法之一就是 GST
沉澱實驗。GST 沉澱實驗主要是用來證明蛋白質胞外的相互作用。蛋白質在胞外的相互作用排除了酵母細胞內復雜體系的干擾，，比較直接地檢驗蛋白質分子之間存在的物理的相互作用。同酵母雙雜交實驗一樣，運用此法也可以證明相互作用的蛋白分子中是否有參與調節作用的結構域或 motif。GST 沉澱實驗原理就是，把你要研究的蛋白基因亞克隆到帶有GST（谷胱甘肽轉移酶）基因的原核表達載體中，並在細菌中表達 GST 融合蛋白（GST-X）。把 GST 融合蛋白掛到帶有 GST 地物的 Sepharose beads 上，然後把另一種蛋（Y）白加入其中。由於蛋白質之間的結合作用，形成了這樣的復合物：GST-X----Y。這一復合物與固體支持物（Sepharose beads）又
結合在一起，可以被沉澱下來。此法又有在不同情況下的具體應用，以下一一作介紹。
（1） GST 融合蛋白與重組蛋白的相互作用
GST 融合蛋白是在原核表達的，所以沒有經過過多的象真核細胞內具有的蛋白修飾作用。
所以另一種用來檢驗相互作用的蛋白也可以用原核表達出來，也就是所謂的重組蛋白。當 GST融合蛋白把重組蛋白沉澱下來，然後用重組蛋白的抗體作 Western blotting 檢測。
（2） GST 融合蛋白與體外 TNT 系統合成的多肽或蛋白的相互作用
用來檢驗與GST融合蛋白相互作用的蛋白或多肽也可以用TNT體外蛋白合成體系進行合
成，並且還可以在要合成的蛋白或多肽N端或C端加上便於檢測的標簽。GST融合蛋白沉澱下來的蛋白或多肽可以用該蛋白或多肽的抗體或標簽抗體進行Western blotting檢測。如果蛋白之間結合力非常弱，用Western blotting檢測方法難以檢測到，你可以在TNT體外合成時給蛋白進行同位素（S32）標記。這樣沉澱下來的蛋白進行放射自顯影，檢測靈敏度將極大提高。
（3） GST 融合蛋白與細胞內源性蛋白質的相互作用
GST融合蛋白還可以把細胞提取物中有相互作用的內源性蛋白質沉澱下來。如果內源性蛋
白含量低或結合力弱，可以採用脈沖法使細胞在某一段時間內合成的所有蛋白質都標記上放射性同位素（S32），然後提取細胞總蛋白與GST融合蛋白溫育。GST融合蛋白沉澱下的帶有放射性標記的蛋白跑電泳，進行放射自顯影。
（4） GST 融合蛋白與細胞內瞬時表達的蛋白質的相互作用
當內源性蛋白質含量低，並且有可能影響蛋白質的相互作用，也可以把該蛋白的基因轉染
到靶細胞內進行過表達，然後檢驗蛋白質相互作用。
（5） GST 融合蛋白與待測蛋白的相互作用有可能與待測蛋白的磷酸化狀態有關在進行 GST 沉澱實驗時，有時也會遇到比較復雜的情況，具體情況具體分析，分別對待。比如，兩個蛋白質之間發生相互作用時有可能與蛋白磷酸化狀態有關。或者蛋白首先被磷酸化後方能產生相互作用，或者磷酸化的蛋白必需脫磷酸化後才能產生相互作用。如果你確實在你
的實驗中發現了其中一種情況，這將是一個非常有意義的結果。
3， 免疫共沉澱（co-immunoprecipitation ）（細胞內蛋白質相互作用）9-16
免疫共沉澱技術用來證明蛋白質在胞內是否有相互作用。一般來說，兩種蛋白在細胞內發
生相互作用時會形成兩種蛋白的復合物，這樣就可以先用一種蛋白的抗體把免疫復合物沉澱下來，然後用另一種蛋白的抗體進行 Western blotting 檢測，看兩種蛋白之間是否確實形成免疫復合物，並能與 protein A/G agarose 一起沉澱下來。免疫共沉澱原理簡單，但技術極為復雜。因為細胞內蛋白種類繁多，制約因素多。如果兩種蛋白之間可以發生相互作用，並不是這兩種蛋白所有分子都參與結合作用，也可能只有極少部分蛋白分子結合在一起（足以滿足細胞功能需要）。在提取細胞蛋白時，如果條件不當就會破壞兩種相互作用蛋白形成的復合物的穩定性，使得免疫共沉澱實驗失敗。如果兩種蛋白在細胞內的結合力確實非常弱，那麼免疫共沉澱也難以成功。如果知道發生相互作用的兩個蛋白都是胞核蛋白，那麼可以通過提取核蛋白，再進行免疫共沉澱實驗，這樣會大大減低背景的干擾。關於兩種蛋白質之間胞內的相互作用，有時確實無法用免疫共沉澱實驗證明。
（1） 細胞內過表達蛋白的免疫共沉澱
證明蛋白質胞內相互作用時，可以選擇一個高效瞬時過表達系統（至於這一系統是否有內
源性靶蛋白無關緊要）。一般採取 COS 細胞作為真核表達株。把兩種蛋白基因共轉染到 COS 細胞內進行表達。由於人為進行大量表達，所以在胞內兩種蛋白形成相互作用的復合物的量也相應增多。如果你手頭沒有這兩種蛋白的抗體，可以把這兩種蛋白的一端分別加上標簽以融合蛋白形式表達，然後用商業化的抗標簽抗體進行免疫共沉澱和 Western blotting 檢測。
（2） 細胞內源性蛋白的免疫共沉澱
把兩種蛋白共轉染到 COS 細胞內進行過表達，進行免疫共沉澱實驗，相對容易成功，但是
這一結果畢竟具有人工性，不能代表生理條件下真實的蛋白質相互作用。要想克服這一弱點，
可以做內源性的免疫共沉澱實驗。這一技術要求極高，難度極大，但也最有說服力。因為細胞內內源性蛋白含量低，結合在一起形成復合物的量更低，難以檢測。首先要證明所選擇的細胞系是否具有這兩種內源性的蛋白。另外，用於免疫沉澱和 Western blotting 檢測的抗體要好。細胞裂解、收集以及免疫沉澱時時條件要溫和，以保持蛋白復合物的天然結構。
（3） 組織內蛋白的免疫共沉澱
在體外可以大量培養細胞，然後制備細胞提取物，做內源性免疫共沉澱。由此可以推廣到做
組織內免疫共沉澱。取動物組織（腦、肝、脾等），切碎，勻漿，提取組織蛋白，進行免疫共沉澱實驗。這一結果代表活體中蛋白質相互作用。
4， 蛋白質細胞內定位實驗17-22
另一種經常用來檢驗蛋白質相互作用的方法是蛋白質細胞內定位技術。此法較為直觀，可
以看到兩種有相互作用的蛋白質在細胞內的分布（膜上、胞漿、胞核或其它細胞器等等）以及共定位的部位（在膜上共定位、在胞漿中某一部位或核內共定位等等）。有時相互作用的蛋白由於細胞內某種功能的需要結合在一起時，使得兩種蛋白的分布發生變化。比如，某種蛋白也許在核內，當它與另一種具有穿梭功能的蛋白結合時，有可能被轉運到胞漿中。這種情況的共定位則較為典型。在進行蛋白質共定位
（1） 利用有色熒光蛋白標記技術進行蛋白定位研究
此法也可稱為活細胞定位。把兩種具有相互作用的蛋白分別克隆到帶有兩種不同顏色熒光
蛋白（綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白）的載體中，共轉染到功能細胞中（一般選用 COS7 細胞）表達帶有熒光的融合蛋白。這樣，相互作用的兩種蛋白就被標上不同的熒光，可以在細胞內用熒光顯微鏡直接觀測。在進行精確細胞定位或共定位時，必須用共聚焦熒光顯微鏡觀測。因為共聚焦熒光顯微鏡（相當於醫院給病人診斷的 CT）觀測的是細胞內一個切面上的顏色。如果在一個切面上在同一區域看到兩種顏色，就提示這兩種蛋白在該區域內有相互作用。普通熒光顯微鏡看到的是一個立體圖象，無法確定蛋白質共定位現象。在進行定位或共定位同時，也可以對細胞核進行染色。這樣，在細胞中就有三種顏色。細胞核的顯色幫助你確定共定位發生的位置。上面介紹的活細胞定位，其優點是表達的熒光蛋白熒光強，沒有背景，觀測方便。但缺點
是相互作用的蛋白由於標上熒光蛋白，實際上是兩個融合蛋白。融合蛋白的定位結果或共定位結果是否與天然蛋白分布一致，有待於進一步確定。而利用免疫熒游標記技術可以避免這一缺點。
（2） 利用雙色或多色染色的免疫熒光技術進行蛋白定位研究
免疫熒光的原理是，首先把細胞進行固定，然後用待檢測靶蛋白的抗體（一抗）與細胞內
靶蛋白進行免疫反應，再用熒光素（如 FITC 和 TRITC 等）標記的二抗與一抗進行反應。這樣就在細胞內形成免疫復合物（靶蛋白----一抗---二抗），結果靶蛋白被標上顏色，然後可用共聚焦熒光顯微鏡觀測定位與共定位結果。
免疫熒光技術最大優點就是可用來檢測細胞內源性蛋白的定位及相互作用。當然也可以對
靶細胞進行轉染表達目的蛋白，然後標記目的蛋白進行觀測。免疫熒光技術的缺點是熒光相對較弱並且背景較高，結果受到干擾，所以這項技術不好掌握。為了結果的可靠性，要求嚴格設計陽性對照與陰性對照。
（3） 細胞內蛋白動態定位
有時細胞在正常狀態下，有相互作用的蛋白在胞內可能暫時分開，沒有共定位現象發生。
但是在某一個特定情況下，如細胞受到外界刺激時，細胞本身會產生應急反應，這時暫時分離的蛋白有可能發生相互作用，並產生共定位現象。所以在進行共定位研究時，可根據具體情況具體分析，必要時觀測細胞內蛋白動態定位結果。

Ⅲ 單克隆抗體與基因克隆技術相結合

汗……樓上寫得太復雜了……

單克隆抗體原理：
用特定的淋巴免疫B細胞產生某種需要的特定抗體，抗體會和待鑒定的抗原發生基因工程中鑒定專用的「抗原-抗體結合」技術，就可以准確分離和鑒定出相應的蛋白質。

簡單的單克隆抗體制備過程：
1 向目標生物體中注射相應的抗原並獲取相應的抗體和免疫B淋巴細胞。
2 用動物細胞融合技術將目的淋巴B細胞和骨髓瘤細胞融合，產生新的雜交瘤細胞。
3 使用特定方法分理處需要的骨髓瘤細胞（就是特定B細胞和骨髓瘤的雜交瘤細胞）。

基因克隆技術：
就是通稱的體外細胞復制PCR技術。使用基因工成分里獲取的目的基因在PCR復制儀中復制。當然也可以用自動序列分析儀分析之後人工編碼DNA。

Ⅳ elisa檢測中二抗時間延長會造成什麼影響

• 二抗孵育

• 參考二抗的說明書，按照適當比例用封閉液稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗。

• 吸盡洗滌液後，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在搖床上緩慢搖動孵育1~2小時。回收二抗。然後加入Western洗滌液，在搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鍾。吸盡洗滌液後，再加入洗滌液，洗滌5-10分鍾。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間並增加洗滌次數。

• 前2步洗滌是為了洗去一抗和二抗的非特異性結合，洗滌的效果直接影響結果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。洗滌液使用 TBST 或者 PBST,其中的 Tween20 有助於去除非特異性的結合，減少背景。同時短時間多次的洗膜比長時間少次數的洗膜更有效。

• 第3步TBS洗滌是為了洗去膜上的Tween-20,因為它可以阻礙底物的沉積。

• 注意事項

• 1) 抗體保存注意事項：

• 2)收到抗體後按要求離心後再打開管蓋進行分裝和保存!

• 3)對於大部分抗體，比較合適的保存方式是分裝後保存在-20℃ .

• 4)分裝的量以一次實驗用完為好，最少不能少於10 ul每份。因為分裝體積越小，抗體的濃度越可能會受到蒸發以及管壁吸附的影響。

• 5)復融後的分裝抗體如果一次用不完，將剩餘母液保存在40℃，避免再凍起來!

• 6)絕對避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。

• 7)大部分抗體收到後40℃短暫保存1-2周對抗體活性是沒有影響的。

• 8)長期保存，加入疊氮納，防止細菌污染。

• 一抗/二抗使用問題：

• 一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說明書選擇最適當的比例，一抗二抗的選擇直接影響實驗結果以及背景的深淺。要嚴格保證反應時間，洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利於降低背景;還要注意一抗二抗的匹配。

• 天然和非還原樣品問題：

• 有些抗體只能識別的表位是非連續氨基酸，這些氨基酸雖然在蛋白質一級結構中彼此不連續，但是在空間結構中則是靠在一起的。這些抗體就只能識別靶蛋白的空間結構狀態。對於這些樣品，緩沖液和凝膠中就不能含有SDS,並且不能夠對蛋白進行加熱變性。

Ⅳ 單克隆抗體的鑒定實驗

1．雜交瘤細胞染色體的檢查採用秋水仙素裂解法進行。2．單克隆抗體的類型、亞型的測定：購買兔抗小鼠Ig類型和亞型的標准抗血清，採用瓊脂擴散法或ELISA夾心法測定單抗的Ig類型和亞型。
ELISA夾心法測定單抗的Ig類型和亞型的試劑盒說明書 1、首先將試劑盒恢復室溫（大約30分），然後用純水把清洗液配成工作濃度（一份濃縮清洗液加19份純水）。
2、取出酶標板。每個標本需要6孔，陽性對照6孔。多餘的用自封袋保存，記得放入乾燥劑。
3、將細胞培養上清（或特異親和純化的抗體）50μl加入酶標微孔板，每個標本加6孔，陽性對照也是加6孔每孔50μl。然後每孔再加入50μl標本稀釋液。貼上封板膜37℃溫育30分鍾。
4、棄去板內液體，洗板5遍後在不掉纖維的吸水材料上拍干或機洗5遍。再在每個標本的6孔中分別加入6種酶標二抗各100μl，通用陽性對照的6孔也一樣。在加樣圖上或酶標板上做好標記。貼上封板膜37℃溫育30分鍾。
5、吸棄板內液體，洗板5遍後在不掉纖維的吸水材料上拍干或機洗5遍。每孔分別加入顯色劑A和顯色劑B各50μl，換一張新的封板膜貼板避光37℃顯色20分鍾。
6、本試劑盒特異性好一般肉眼即可觀察出結果，看顯色藍的那個孔所對應的酶標二抗就知道此標本的Ig類或亞類。更可將反應終止液（每孔50μl）終止反應後用酶標儀450nm測定波長，630nm參考波長雙波長測定結果，參看高值孔所對應的酶標二抗就知道此標本的Ig類或亞類。陽性對照0D小於0.5實驗無效，需要重做。 1、雖然本試劑盒過期後很久還有使用價值但還是請您在有效期內使用。
2、在檢測腹水類單抗時要稀釋到1/5萬，雖然可以分辨但並不建議您這樣做。此類樣品成分十分復雜，有干擾結果的可能。在此種情況下您可以選擇本公司的C030215抗體鑒定試劑。它會給您帶來滿意的結果。
3、手洗板子時一定要把孔加滿，停留10秒然後棄盡，最後要拍干凈。特別是在酶標二抗溫育後洗板時一定要把酶吸出而不是甩出，要吸凈。這個在手工洗板時對結果很重要。
4、一次沒用完的板子要帶乾燥劑放自封袋封好，隨盒存放。
5、拿放板子時不要劇烈抖動，以免孔間交叉污染出現錯誤結果。
6、出現異常結果請隨時咨詢我們。
3．單抗的特異性鑒定可以採用各種方法，如免疫熒光法、ELISA法、間接血凝和免疫印跡技術等，同時還需做免疫阻斷試驗等。
4．單抗的效價測定可採用凝集反應、ELISA或放射免疫測定。不同的測定方法效價不同。培養上清液的效價遠不如腹水的效價。採用凝集反應，腹水效價可達5×104。而採用ELISA檢查，腹水效價可達1.0×106。單抗的效價以培養上清和腹水的稀釋度表示。
5．必要時還可以測定單抗的親和力和識別抗原表位的能力測定。

Ⅵ 酶聯免疫吸附測定實驗（ELISA）的操作流程，謝謝大家

Elisa 操作流程（以人IL-4 ELISA KIT為例）：
檢測原理:
本實驗採用雙抗體夾心ELISA法。抗人IL-4單抗包被於酶標板上，標本和標准品中的IL-4會 與單抗結合，游離的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗體和辣根過氧化物酶標記的親 和素。生物素與親和素特異性結合；抗人IL-4抗體與結合在單抗上的人IL-4結合而形成免疫 復合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，若反應孔中有IL-4，辣根過氧化物酶會使無色 的顯色劑現藍色，加終止液變黃。在450nm處測OD值，IL-4濃度與OD450值之間呈正比，可 通過繪制標准曲線求出標本中IL-4的濃度。
試劑盒組成：
1．抗體預包被酶標板（8×12 或 8×6）
2．凍干標准品（2 / 1 支；0.5ng/支）
3．標准品和標本稀釋液（橙蓋瓶）（1 瓶；20ml/12ml）
4．濃縮生物素化抗體（紫蓋瓶）（1 支）
5．生物素化抗體稀釋液（藍蓋瓶）（1 瓶；16ml/10ml）
6．濃縮酶結合物（棕蓋瓶）（1 支）
7．酶結合物稀釋液（紫蓋瓶）（1 瓶；16ml/10ml）
8．濃縮洗滌液 20× （白蓋瓶）（1 瓶；50ml/25ml）
9．顯色底物（TMB）（棕蓋瓶）（1 瓶；12ml/6ml）
10．反應終止液（紅蓋瓶）（1 瓶；12ml/6ml）
11．封板膠紙（6/3 張）
12．產品說明書（1 份）
標本收集:
1. 收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。
2. 血漿抗凝劑推薦使用EDTA。避免使用溶血，高血脂標本。
3. 標本應清澈透明，懸浮物應離心去除。
4. 標本收集後若不及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存於-20℃，-70℃電冰箱內，避免反復凍融，3-6月內檢測。
5. 如果您的樣本中檢測物濃度高於標准品最高值，請根據實際情況，做適當倍數稀釋(建 議做預實驗，以確定稀釋倍數)。
注意事項:
1. 試劑盒使用前請保存在2-8℃。復溶後的標准品應分裝後，將其放在-20～-70℃貯存。
2. 濃縮生物素化抗體，濃縮酶結合物體積小，運輸中顛簸和可能的倒置，會使液體沾到管壁 或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000轉/分離心1分鍾，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。
3. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶,屬於正常現象，微加熱至40℃使結晶完全溶解後 再配製洗滌液。（加熱溫度不要超過50℃）使用時洗滌液應為室溫。
4. 若需要分次使用標准品應按照每一次用量分裝，將其放在-20～-70℃貯存。避免反復凍 融。
5. 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應終止液除外）。
6. 充分輕微混勻對反應結果尤為重要，最好使用微量振盪器(使用最低頻率)，如無微量振盪器，可在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。
7. 在試驗中標准品和樣本檢測時建議作雙孔檢測。
8. 試驗中所用的試管和吸頭均為一次性使用，嚴禁在不同的液體之間混用！否則將影響試 驗結果。
9. 試驗中請穿著試驗服並帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液標本時， 請按國家生物試驗室安全防護條列執行。
檢測前准備工作:
1. 請提前20分鍾從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:20)。未用完的放回4℃。
3. 標准品: 加入標准品/標本稀釋液0.5ml至凍干標准品中，靜置15分鍾，待其充分溶解後，輕輕混勻(濃度為1000 pg/ml)。然後根據需要進行稀釋。(建議標准曲線使用以下濃度： 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)。復溶標准品原液（1000 pg/ml）若未用完請分裝後放入-20℃以下電冰箱內保存，保存兩個月。已稀釋的標准品請廢棄。
4. 生物素化抗體工作液：按當次試驗所需要得用量，使用前20分鍾，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:30)成工作濃度。當日使用。若實驗次數過多導致生物素化 抗體量不足，可向我們公司單獨購買生物素化抗體。（須提供抗體批號）
5. 酶結合物工作液：按當次試驗所需要得用量，使用前20分鍾，以酶結合物稀釋液稀釋濃 縮酶結合物(1:30) 成工作濃度。當日使用。若實驗次數過多導致濃縮酶結合物量不足， 可向我們公司單獨購買濃縮酶結合物。（須提供酶結合物批號）
洗滌方法:
1. 自動洗板機：要求注入的洗滌液為350ul，注入與吸出間隔15－30秒。洗板5次。
2. 手工洗板：甩盡孔內液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350ul，靜置30秒後甩盡液體，在厚迭吸水紙上拍干。洗板5次。

操作步驟:
1．從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和乾燥劑請放回鋁箔袋內壓 實自封條，密封口袋，放回4℃。
2．空白孔加標准品和標本稀釋液，其餘相應孔中加標本或不同濃度標准品(100ul/孔)，用封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱孵育90分鍾。
3．提前20分鍾准備生物素化抗體工作液。
4．洗板5次。
5．空白孔加生物素化抗體稀釋液，其餘孔加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用新封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱孵育60分鍾。
6．提前20分鍾准備酶結合物工作液。避光室溫(22-25 ) ℃ 放置。
7．洗板5次。
8．空白孔加酶結合物稀釋液，其餘孔加入酶結合物工作液(100ul/孔)。用新封板膠紙封住反應孔，36℃孵箱，避光孵育30分鍾。
9．打開酶標儀電源，預熱儀器，設置好檢測程序。
10．洗板5次。
11．加入顯色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分鍾。
12．加入終止液100ul/孔, 混勻後即刻測量OD450值(3分鍾內)。在儀器保存讀數結果並列印一份紙質結果。
13．實驗完畢後將未用完的試劑按規定的保存溫度放回電冰箱保存至有效期結束。
建議保存酶標板框，以備下次或者今後試驗使用。

結果判斷:
1. 每個標准品和標本的OD值應減去空白孔的OD值。
2. 手工繪制標准曲線。以標准品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標准品的坐標點。通過標本的OD值可在標准曲線上查出其濃度。
3. 若標本OD值高於標准曲線上限，應適當稀釋後重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數。

靈敏度、特異性和重復性:
● 靈敏度：最小可測人IL-4達7pg/ml。
● 特異性：不與IL－1,2,3,5,6,8,10,12,IFN,TNF及sTNF-RII等反應。
● 重復性：板內，板間變異系數均<10%。

Ⅶ 有誰知道ELISA單組分顯色液怎麼配

這個你在網路上是基本不可能找到答案的，目前TMB的顯色液配方有經典的AB法，這個隨便網路一下就可以找到．但單組分的東東，還是比較保密的．一些公司不可能流轉出來的．就算是弄好了，也不會輕易告訴別人的．
如果你是實驗室自己想用一下，而且用量不大的話，可以訂一點點，或者自己配成AB法的．
如果是公司想生產試劑盒．直接配成AB型的或者訂現成的，再或者花錢賣這個配方．但價格就不好說．

Ⅷ 求助一份萊克多巴胺試劑盒說明書

http://www.instrument.com.cn/show/download/shtml/007939.shtml

上面網址有 說明書下載

Ⅸ 瘦肉精檢測的檢測

GB/T 5009.192-2003 動物性食品中克倫特羅殘留量的測定
氣相色譜-質譜法（GC-MS）
GC-MS法優點是把色譜高效快速的分離效果和質譜高靈敏度的定性分析有機合起來，能在多種殘留物同時存在的情況下對某種特定的殘留物進行定性、定量分析，而且具更高的檢測極限。Fente C. A等用GC-MS法檢測牛毛中CLB的殘留，最低檢測限為5ng/g；Pteer Batioens應用氣相色譜－串聯質譜法(GC-MS-MS)對牛、羊、豬組織中的CLB含量進行檢測，最低檢測限為2ng/g；劉琪等用GC-MS法（EI離子源）檢測豬尿中的CLB，檢測限為0.5ng/mL；VanRhijin等用三甲基硅基或2-二甲基硅基嗎啉衍生物檢測尿提取物中的CLB，衍生物用電脈沖方式或化學離子化方式掃描，會產生更高的靈敏度。另外，GC-MS法與HPLC法相比，檢測靈敏度更高，假陽性率更低。因此，我國將GC-MS法定為檢測CLB的確證性方法（NY/T468~2001）。
高效液相色譜法（HPLC）
HPLC適合測定熱不穩定和強極性的β-激動劑及其代謝產物，而且，HPLC可以與柱前提取、純化及柱後熒光衍生化反應和質譜(MS)等系統聯用，容易實現分析過程的自動化。黃士新等(1995)應用紫外檢測器，在λ=243nm，色譜柱：shimpackCLC-ODS150×6.0mn，流速：1mL/min，柱溫：室溫30℃的條件下檢測豬肝臟和豬肉中的CLB殘留，最低檢測限可達2ng/g[4]。國外有人應用HPLC (二極體陣列檢測器)測定動物性食品中CLB殘留，測得最低檢測限為1.26ng/g，回收率達98.9%[5]。目前，我國已將HPLC法作為檢測CLB殘留的半確證性方法，最低檢測限范圍為1～15ng/g，其優點是專屬性好、選擇性強、檢測精確度較高，而且假陽性率低；缺點是樣品處理時間長，檢測過程煩瑣、難於操作，需貴重儀器，在實際應用中受到一定的限制。
酶聯免疫吸附法（ELISA ）
利用免疫學抗原抗體特異性結合和酶的高效催化作用，通過化學方法將植物辣根過氧化物酶（HRP）與克倫特羅（CL）結合，形成酶偶聯克倫特羅。將固相載體上已包被的抗體（羊抗兔IgG抗體）與特異性的抗克倫特羅抗體結合，然後加入待測克倫特羅和酶偶聯克倫特羅，它們競爭性與克倫特羅抗體結合，洗滌後加底物，根據有色物的變化計量待測克倫特羅量。若待測克倫特羅多，則被結合的酶偶聯克倫特羅少，有色物量就少。用目測法或比色法測定樣品中的克倫特羅含量，比色的最佳波長為450 nm，參比波長應大於600 nm。
膠體金免疫層析法（Colloidal gold immunochromatography）
利用競爭法膠體金免疫層析技術，檢測液中的Clen與金標墊上的金標抗體結合形成復合物，若Clen在檢測液中濃度低於靈敏度值，未結合的金標抗體流到T區時，被固定在膜上的Clen-BSA偶聯物結合，逐漸凝集成一條可見的T線；若Clen濃度高於靈敏度值，金標抗體全部形成復合物，不會再與T線處Clen-BSA偶聯物結合形成可見T線。未固定的復合物流過T區被C區的二抗捕獲並形成可見的C線。C線出現則表明免疫層析發生，即試紙有效. 1. 在進行測試前先完整閱讀使用說明書，使用前將試劑板和待檢樣本溶液恢復至室溫。
2. 撕開鋁塑袋，取出試紙。
3. 依據型號進行操作（尿液不得直接浸濕觀察區）。
3.1 將試紙白色一端浸入尿液中（液面不得超過橫線），保持5秒鍾；
3.2 用滴管吸取待檢樣品尿液，逐滴緩慢加入3滴樣品於加樣孔中。
4. 將試紙平放1分鍾，等待紅色條帶出現。
5. 3～8分鍾內讀取結果，10分鍾後判讀無效。
6. 10分鍾內可以檢測出結果 陽性（+）：僅質控區（C）出現一條紫紅色條帶。在測試區（T）內無紫紅色條帶出現。
陰性（-）：兩條紫紅色條帶出現。一條位於測試區（T）內，另一條位於質控區（C）內。
無效：質控區（C）未出現紫紅色條帶，提示測試失敗或試 紙已失效。
注意：測試區（T）內的紫紅色條帶可顯現出顏色深淺的現象。但是，在規定的觀察時間內，不論該色帶顏色深淺，即使只有非常弱的色帶也應判定為陰性結果。 1.檢測卡請在保質期內一次性使用。
2.檢測時避免陽光直射和電風扇直吹。
3.盡量不要觸摸檢測卡中央的白色膜面。
4.尿樣滴管不可混用，以免交叉污染。
5.如果尿樣出現沉澱或渾濁物，請離心後再檢測。
液相色譜—質譜/質譜法（HPLC-MS/MS）
參見SN/T 1924—2007 進出口動物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林殘留量的檢測方法。
本標准適用於動物源性食品肌肉和內臟中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林殘留量的檢測。
試樣中的葯物殘留採用pH5.2的乙酸銨緩沖液提取，同時加入β-鹽酸葡萄糖醛甙酶-芳基硫酯酶進行酶解後，提取液經C18和SCX雙SPE柱凈化，液相色譜—質譜進行測定，內標法定量。

Ⅹ RNA 變性PAGE的配製方法

氯仿是分子量比較大的有機溶劑,在提取rna時,氯仿可以有效的使有機相和無機相迅速分離.dna提取過程
有機相中主要是酚和蛋白結合,從而使得蛋白和dna脫離,dna進入水相.但是在rna的提取過程就要避免蛋白和dna脫離,否則dna會釋放到水相.不管有酚也好,沒有酚也好,氯仿本身也對蛋白有變性作用,劇烈的震盪,很容易使得dna的親水基團,與水相接觸.所以不要劇烈震盪.
異丙醇的作用是通過-oh的疏水作用使得rna
或者dna鏈中的親水基團受到保護,等同於沉澱,但是這是個反應時發生在水相中,與前面的氯仿不矛盾.
氯仿的作用有多個方面,一是作為有機溶劑變性蛋白,使其沉澱並通過離心除去,同時也通過變性作用抑制rnase活性；二是rna提取試劑中通常含有苯酚（trizol主要成分就是苯酚,很多自己配試劑提的方法也用苯酚,抽提蛋白時也會用到苯酚）,苯酚微溶於水,抽提烷之後水相里有痕量的酚,如果不除去會損傷核酸,需要通過氯仿把水相里參與的苯酚抽提掉；三是作為溶劑抽提樣品中的一些脂溶性雜質（比如油脂、脂溶性色素等）,起到一定除雜作用
通常氯仿裡面會加少量異戊醇（1/25）,減少蛋白質在變性過程中由於震盪產生的泡沫,影響後續操作,不過個人經驗感覺加不加沒什麼太大區別,也許是我的樣品里蛋白不多吧
異丙醇是沉澱核酸用的,作用和乙醇一樣.只不過用量少一點,0.6v~1v就夠了,不像乙醇沉澱需要至少2v,一般需要2.5倍體積.在水相很多,離心管容積有限,加不下太多乙醇的時候一般會用異丙醇沉澱.不過感覺效果不如乙醇,偶爾會有沉澱不出來東西的時候