發明了鏈終止法進行測序

1. 英國科學家Sanger因發明了鏈終止DNA測序法而獲諾貝爾獎．其主要內容步驟是：先向DNA復制體系中加入能夠終

（1）讓DNA分子的兩條鏈分開，在體外是採用加熱變性的方法，在活細胞內依靠DNA解旋酶．
（2）由於模板鏈中含N個腺嘌呤脫氧核苷酸，標記物是腺嘌呤脫氧核苷酸，通過上述操作能得到N種長度不同的脫氧核苷酸鏈．
（3）各種長度不同的脫氧核苷酸鏈的分子量不同，因而可以通過電泳將它們分離開來．
（4）鹼基G所在的核苷酸為鳥嘌呤核苷酸，所以若用上述測序方法讀出鹼基G的位置，則必須加入帶標記的鳥嘌呤核苷酸．
（5）按上圖模式每操作1次，能夠測出一條鏈中1種鹼基的位置，DNA分子中有4種鹼基，操作3次就能測出DNA一條鏈上3種鹼基的位置，空位自然是第4種鹼基．再根據鹼基互補配對原則，可推知DNA片段上另一條鏈的鹼基順序．所以從理論上講，只要按上圖模式操作3次，就能測定一段雙鏈DNA中的全部鹼基順序．
故答案為：
（1）解旋酶
（2）N
（3）分子量
（4）鳥嘌呤核苷酸
（5）3

2. 末端終止法測序的原理和方法

末端終止法測DNA序列即SANGER雙脫氧鏈終止法,其原理是:

DNA鏈中核苷酸以3』,5』-磷酸二酯鍵連接，合成DNA所用的底物是 2』-脫氧核苷三磷酸。2』,3』ddNTP與普通dNTP不同，它們在脫氧核糖的3』位置缺少一個羥基。在DNA聚合酶作用下通過三磷酸基團摻入到延伸的DNA鏈中，但由於沒有3』羥基，不能同後續的dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，正在延伸的DNA鏈不能繼續延伸。在DNA合成反應混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP，鏈延伸將與偶然發生但卻十分特異的鏈終止競爭，產物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決於引物末端到出現過早鏈終止位置間的距離。在4組獨立酶反應中分別採用4種不同的ddNTP，結果將產生4組寡核苷酸，它們將分別終止於模板鏈的A、C、G或T位置。

3. 可逆末端終止測序法的原理

雙脫氧末端終止法

在模板指導下，聚合酶不斷將dNTP加到引物的3』-OH末端，使引物延長，合成出新的互補的DNA鏈，如果加入雙脫氧三磷酸核苷(ddNTP）,由於雙脫氧核糖的3』位置上缺少一個羥基，故不能同後續的dNTP形成磷酸二酯鍵，即形成一種全部具有相同5』-引物端和以ddNMP殘基為3』端結尾的一系列長短不一片段的混合物。採用聚丙烯醯胺凝膠電泳區分長度差一個核苷酸的單鏈DNA，從而讀取DNA的核苷酸序列。

雙脫氧鏈終止法是現在應用最多的核酸測序技術，由Sanger等1977年提出。

其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧鹼基存在條件下復制或轉錄時，如果在四管反應系統中分別按比例引入四種雙脫氧鹼基，只要雙脫氧鹼基摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端摻入單脫氧鹼基的片段可繼續延長。如此每管反應體系中便合成以共同引物為5』端，以雙脫氧鹼基為3』端的一系列長度不等的核酸片段。反應終止後，分四個泳道進行電泳。以分離長短不一的核酸片段(長度相鄰者僅差一個鹼基)，根據片段3』端的雙脫氧鹼基，便可依次閱讀合成片段的鹼基排列順序。

(一) Sanger雙脫氧鏈終止法(酶法)測序程序 操作程序是按DNA復制和RNA反轉錄的原理設計的。

1. 分離待測核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是雙鏈，也可以是單鏈。

2. 2.在4隻試管中加入適當的引物、模板、4種dNTP(包括放射性標記dATP，例如?32 PdATP和DNA聚合酶（如以RNA為模板，則用反轉錄酶），再在上述4隻管中分別加入一種一定濃度的ddNTP(雙脫氧核苷酸)。

3. 3.與單鏈模板（如以雙鏈作模板，要作變性處理)結合的引物，在DNA聚合酶作用下從5』端向3』端進行延伸反應，32P隨著引物延長摻入到新合成鏈中。當ddNTP摻入時，由於它在3』位置沒有羥基，故不與下一個dNTP結合，從而使鏈延伸終止。ddNTP在不同位置摻入，因而產生一系列不同長度的新的DNA鏈。

4. 4.用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳同時分離4隻反應管中的反應產物，由於每一反應管中只加一種ddNTP(如ddATP)，則該管中各種長度的DNA都終止於該種鹼基(如A)處。所以凝膠電泳中該泳道不同帶的DNA 3』 末端都為同一種雙脫氧鹼基。

5. 5.放射自顯影。根據四泳道的編號和 每個泳道中DNA帶的位置直接從自顯影圖譜上讀出與模板鏈互補的新鏈序列。
   

4. 雙脫氧末端終止法測序的基本步驟包括哪些

以雙鏈DNA測序為例，雙脫氧末端終止法的基本步驟包括：變性雙鏈模板的制備和延伸和終止反應。

1、變性雙鏈模板的制備

① 取1.5ml處於對數生產期的培養菌液（含有待測病毒核酸的重組質粒模板），離心除去上清液後，用150ml Tris/葡萄糖緩沖液重懸菌團，在室溫下放置5分鍾。

② 加入300ml的1%SDS，0.2mol/L NaOH，顛倒混合約15次，在室溫下放置15分鍾，加入225ml 3mol/L醋酸鈉（pH4.5），顛倒約15次混合，在冰浴中放置45分鍾，離心5分鍾。

③ 將650ml上清液轉移至一支新管中，加入650ml異丙醇，混合後在室溫下放置10分鍾，離心5分鍾後棄去異丙醇，抽真空乾燥沉澱。

④ 用125ml TE(pH 8.0）重新溶解DNA，加入375ml的4mol/L LiCl，在冰浴中放置20分鍾後，於4℃下離心5分鍾。

⑤ 將上清液轉移至一支新管中用飽和苯酚抽提後再用氯仿抽提，加入2倍體積的異丙醇，在室溫下沉澱30分鍾，離心5分鍾，棄去上清液。

⑥ 用冰冷的70%乙醇洗沉澱，離心5分鍾，棄去上清液並乾燥，用50ml TE緩沖液重新溶解沉澱。用紫外分光光度計測定質粒DNA含量。

⑦ 取0.2mg質粒DNA，並將體積調至9ml，加入1ml 2mol/L NaOH，2mmol/L EDTA，在室溫下放置5分鍾，加入2ml 30mol/L醋酸鈉（pH 4.5）和8ml水。

⑧ 加入6ml冰冷無水乙醇，混合後在乾冰/乙醇浴中放置15分鍾，在4℃下離心5分鍾，小心地棄去上清液，用冰冷的70%乙醇洗沉澱，離心5分鍾並小心地棄去上清液，真空抽干沉澱，並用TE緩沖液重新溶解沉澱。

2、延伸和終止反應

以利用T7DNA聚合酶進行的雙脫氧鏈終止反應為例。

① 取4支0.5ml小離心管，標上G、A、T、C，每管加入7ml變性的雙鏈DNA模板（分別為1和2mg），1ml寡核苷酸引物和2ml 5×測序緩沖液混合，65℃保溫2分鍾，在室溫下冷卻30分鍾。

② 每管加入1ml 0.1mol/L DTT，2ml 1.5mol/L 3種dNTP混合物，0.5ml32P dATP和2ml（2IU）修飾的T7DNA多聚酶混合物，在室溫下放置5分鍾。

③ 按標記每管分別加入3ml 4種ddNTP終止混合物的一種。

④ 短促離心後，在37℃下保溫5分鍾。

⑤ 加入5ml甲醯胺上樣緩沖液，上樣前在80℃下加熱2分鍾，並迅速置於冰浴上，每個樣品取3ml，上樣電泳。

⑥讀取合成鏈的核苷酸序列。

(4)發明了鏈終止法進行測序擴展閱讀

延伸和終止反應中測序反應物電泳和序列讀取的注意事項：

（1） 按普通聚丙烯醯胺凝膠製作方法製作梯度膠。

（2） 按G、A、T、C次序加入每種樣品，在G、A和T各泳道上樣1ml，而在C泳道上樣1.5ml。

（3） 上樣完畢加壓1700V電泳，根據樣品中溴酚藍和二甲苯青染料遷移情況確定電泳時間。

（4） 電泳完畢，在10℃冰醋酸中漂洗30分鍾脫去尿素。

（5） 在60℃或80℃乾燥30分鍾後，放射自顯影讀取序列。

5. 雙脫氧末端終止法測序原理

DNA鏈中核苷酸以3』,5』-磷酸二酯鍵連接，合成DNA所用的底物是 2』-脫氧核苷三磷酸。2』,3』ddNTP與普通dNTP不同，它們在脫氧核糖的3』位置缺少一個羥基。在DNA聚合酶作用下通過三磷酸基團摻入到延伸的DNA鏈中，但由於沒有3』羥基，不能同後續的dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，正在延伸的DNA鏈不能繼續延伸。在DNA合成反應混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP，鏈延伸將與偶然發生但卻十分特異的鏈終止競爭，產物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決於引物末端到出現過早鏈終止位置間的距離。在4組獨立酶反應中分別採用4種不同的ddNTP，結果將產生4組寡核苷酸，它們將分別終止於模板鏈的A、C、G或T位置

6. 鏈終止法dna測序技術有何特點

鏈終止法又叫雙脫氧末端測序法，特異性高，可區分一個鹼基的差別，四色熒光，末端終止

7. 雙脫氧鏈終止法的原理

雙脫氧鏈終止法是現在應用最多的核酸測序技術（也即第一代DNA測序技術），由Sanger等1977年發明提出。主要用於DNA基因分析。其原理是：
核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧鹼基存在條件下復制或轉錄時，如果在四管反應系統中分別按比例引入四種雙脫氧鹼基，只要雙脫氧鹼基摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端摻入單脫氧鹼基的片段可繼續延長。
如此每管反應體系中便合成以共同引物為5』端，以雙脫氧鹼基為3』端的一系列長度不等的核酸片段。反應終止後，分四個泳道進行電泳。以分離長短不一的核酸片段（長度相鄰者僅差一個鹼基），根據片段3』端的雙脫氧鹼基，便可依次閱讀合成片段的鹼基排列順序。
Sanger雙脫氧鏈終止法（酶法）測序程序 操作程序是按DNA復制和RNA反轉錄的原理設計的。
1.分離待測核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是雙鏈，也可以是單鏈。
2.在4隻試管中加入適當的引物、模板、4種dNTP（包括放射性標記的ddNTP，例如32P ddNTP和DNA聚合酶（如以RNA為模板，則用反轉錄酶），再在上述4隻管中分別加入一種一定濃度的ddNTP（雙脫氧核苷酸）。
3.與單鏈模板（如以雙鏈作模板，要作變性處理）結合的引物，在DNA聚合酶作用下從5』端向3』端進行延伸反應，32P隨著引物延長摻入到新合成鏈中。當ddNTP摻入時，由於它在3』位置沒有羥基，故不與下一個dNTP結合，從而使鏈延伸終止。ddNTP在不同位置摻入，因而產生一系列不同長度的新的DNA鏈。
4.用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳同時分離4隻反應管中的反應產物，由於每一反應管中只加一種ddNTP（如ddATP），則該管中各種長度的DNA都終止於該種鹼基（如A）處。所以凝膠電泳中該泳道不同帶的DNA 3』 末端都為同一種雙脫氧鹼基。
5.放射自顯影。根據四泳道的編號和每個泳道中DNA帶的位置直接從自顯影圖譜上讀出與模板鏈互補的新鏈序列。

8. 英國科學家Sanger因發明了鏈終止DNA測序法而再獲諾貝爾獎．通過向DNA復制體系中加入能夠終止新鏈延伸的某

（1）DNA分子兩條鏈之間通過氫鍵連接，所以實驗操作的第一步是通過加熱破壞從而使DNA分子的雙鏈打開，在細胞中這是在解旋酶的作用下完成的．
（2）根據鹼基互補配對原則，由於模板鏈的鹼基序列是ATGATCCTG，所以對應合成的最長新鏈的鹼基序列是TACTAGGAC．
（3）據圖分析，要通過以上操作精確地測出DNA鏈上每一個鹼基的位置，電泳分離結果必須能把長度只差一個鹼基（或脫氧核苷酸）的DNA鏈區分開來．
（4）由於鳥嘌呤G與胞嘧啶C配對，所以要從電泳結果直接讀出上圖模板鏈中鳥嘌呤的位置，進行以上操作時，必須加入帶標記的胞嘧啶脫氧核苷酸類似物．由於模板鏈上只有2個鳥嘌呤，所以擴增後將產生2種帶標記的新鏈．
（5）由於經過3次操作可以測出DNA片段的一條鏈上三種鹼基的位置，剩下空位就是第四種鹼基的位置；再根據鹼基互補配對原則，可推知DNA另一條鏈的鹼基順序．因此，採用鏈終止法測定一段DNA雙鏈中的全部鹼基順序，最少要按圖中所示模式操作3次．
故答案為：
（1）氫鍵解旋酶
（2）TACTAGGAC
（3）長度只差一個鹼基（或脫氧核苷酸）的DNA鏈
（4）①加入胞嘧啶脫氧核苷酸類似物（或ddCMP）
②2種 因為模板鏈上只有2個鳥嘌呤（或新鏈上只有2個胞嘧啶）
（5）經過3次操作可以測出DNA片段的一條鏈上三種鹼基的位置，剩下空位就是第四種鹼基的位置；再根據鹼基互補配對原則，可推知DNA另一條鏈的鹼基順序

9. 雙脫氧鏈終止法的Sanger雙脫氧鏈終止法（酶法）測序程序

（一） Sanger雙脫氧鏈終止法（酶法）測序程序 操作程序是按DNA復制和RNA反轉錄的原理設計的。
1.分離待測核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是雙鏈，也可以是單鏈。
2.在4隻試管中加入適當的引物、模板、4種dNTP（包括放射性標記的ddNTP，例如32P ddNTP和DNA聚合酶（如以RNA為模板，則用反轉錄酶），再在上述4隻管中分別加入一種一定濃度的ddNTP（雙脫氧核苷酸）。
3.與單鏈模板（如以雙鏈作模板，要作變性處理）結合的引物，在DNA聚合酶作用下從5』端向3』端進行延伸反應，32P隨著引物延長摻入到新合成鏈中。當ddNTP摻入時，由於它在3』位置沒有羥基，故不與下一個dNTP結合，從而使鏈延伸終止。ddNTP在不同位置摻入，因而產生一系列不同長度的新的DNA鏈。
4.用變性聚丙烯醯胺凝膠電泳同時分離4隻反應管中的反應產物，由於每一反應管中只加一種ddNTP（如ddATP），則該管中各種長度的DNA都終止於該種鹼基（如A）處。所以凝膠電泳中該泳道不同帶的DNA 3』 末端都為同一種雙脫氧鹼基。
5.放射自顯影。根據四泳道的編號和每個泳道中DNA帶的位置直接從自顯影圖譜上讀出與模板鏈互補的新鏈序列。